一个不到400g、能塞进家庭药箱的"掌心实验室"，将RPA恒温扩增与CRISPR/Cas12a技术集成于一体，只需 4 步操作、35 min，就能完成从样本到结果的猴痘病毒核酸检测, 其灵敏度91.7%~95.8%，特异性100%。
其它系列见一种基于磁珠法的可视化核酸检测微流控系统、一种可视化全集成核酸检测微流控芯片、一种手持式可视化核酸检测装置(附视频)、等温扩增技术结合纸条实现病原体可视化检测。
图 1
传统PCR需要反复升降温的"热循环"，而RPA是一种恒温扩增技术——在恒定温度（40℃）下即可完成核酸的指数级扩增，无需复杂的温控设备，大幅简化了操作、缩短了时间。
但，RPA 有一个"老毛病"：容易产生非特异性扩增。实验发现，当仅用EvaGreen染料检测RPA产物时，阴性对照也会产生明显的荧光信号，强度约为阳性组的一半，且曲线呈典型的S型——这在终点检测中极易造成误判。
因此，引入CRISPR/Cas12a后，问题迎刃而解。
Cas12a在gRNA引导下特异性识别RPA扩增产物中的靶序列，激活其反式切割活性，将带有荧光基团和淬灭基团的ssDNA报告探针切割，释放可检测的荧光信号。
即：RPA负责"放大信号"，CRISPR负责"精准识别"，两者协同既保证了灵敏度，又消除了非特异性干扰。
图 2
如图 2，作者将所有试剂和设备集成到一个16cm×10cm×5cm、重量不到400g的"小袋"中。
小袋包含以下关键部件：
图 3
4 步操作，35 min 出结果，整个检测流程只需 4 个步骤：
25 min 后，肉眼即可读取荧光结果——阳性发亮，阴性低背景。全程无需额外操作(图 4)。
图 4
图 4
在优化的反应条件下（MgOAc 28 mmol/L，40℃，RNP 150 nM，报告探针2 μmol/L），RPA-CRISPR/Cas12a 体系的检测能力如下：
同时，作者采用 5 种常见皮肤病相关病原体的DNA验证特异性——水痘-带状疱疹病毒（VZV）、单纯疱疹病毒1型（HSV-1）、单纯疱疹病毒2型（HSV-2）、金黄色葡萄球菌、白念珠菌——无论在生理盐水还是渗出液中，均无非目标病原体产生扩增曲线，表明该体系具有高特异性。
参考文献： MASTR Pouch: Palm-size lab for point-of-care detection of Mpox using recombinase polymerase amplification and CRISPR technology
文章来源于POCT分子诊断，作者尧灵
